1967年，施一公出生在河南省郑州市小郭庄。1984年毕业于河南省实验中学，并获全国高中数学联赛一等奖（河南省第一名），保送至清华大学生物科学与技术系，1989年提前一年毕业，获得学士学位。
1995年获美国约翰·霍普金斯大学医学院分子生物物理博士学位，随后在美国纪念斯隆·凯特琳癌症中心进行博士后研究。
1998年—2008年，历任美国普林斯顿大学分子生物学系助理教授、副教授、终身教授、Warner-Lambert/Parke-Davis讲席教授。
2008年，婉拒了美国霍华德休斯医学中心（HHMI）研究员的邀请，全职回到清华大学工作，任清华大学生命科学学院院长，教授、博导。
2013年4月25日当选为美国艺术与科学学院院士；4月30日 当选美国国家科学院外籍院士；[6]
2013年12月19日当选中国科学院院士。
2013年9月13日，瑞典皇家科学院（Royal Swedish Academy of Sciences）宣布授予清华大学施一公教授2014年度爱明诺夫奖（Gregori Aminoff Prize） 。
2014年12月11日证实，施一公教授已出任清华大学校长助理。
2015年8月，施一公拟出任清华大学副校长。
2015年9月，中科院院士施一公出任清华大学副校长。
2016年3月25日，施一公获“影响世界华人大奖”。
2016年6月2日，中国科协第九次全国代表大会举行第九届全委会第一次会议，施一公当选中国科学技术协会第九届全国委员会副主席。
